内容

1 引言

2 聚合酶链式反应（PCR）

2.1 底漆二聚体形成

3 DNA测序

3.1 桑格（双脱氧）DNA测序

3.2 基于荧光二脱氧DNA测序

3.3 新一代测序

3.4 测序修饰的DNA

3.4.1 亚硫酸氢盐测序

4 DNA指纹

4.5 短串联重复序列

4.6 STR分析

4.7 荧光STR分析

4.8 亲子鉴定

5 单核苷酸多态性（SNP）

6 DNA诊断和突变检测

7 实时PCR

7.1 基于探测的实时PCR

7.2 的TaqMan方法

7.3 荧光共振能量转移（FRET）

7.4 分子信标

7.5 蝎子引物

8 其他诊断方法

8.1 DNA微阵列

9 荧光原位杂交（FISH）

介绍

21世纪初在我们的各种生物，最显着的例子是人类基因组测序的DNA序列的认识经历了一场革命。基因组DNA的分析使我们了解进化了很多，而DNA序列中隐藏的语言不同生物之间的关系，由基因控制的机制，对疾病的易感性。整个基因组的测序是尚未然而，常规技术中，和遗传分析的其它方法用于快速和有效地分析DNA样本。这些方法和技术，如DNA指纹图谱，也改变法医学。

DNA测序，基因和取证分析所有的已建立的方法依赖于使用标记的寡核苷酸和/或脱氧或双脱氧三磷酸核苷，和需要的DNA聚合步骤。这可以是聚合酶链反应（在遗传分析STR分析），单核苷酸延伸（微型测序SNP分析），或聚合和DNA链终止（的组合Sanger测序）。

聚合酶链反应（PCR）

聚合酶链反应（PCR）是在分子生物学，诊断学，法医学和分子遗传学广泛使用，以扩增一个特定区域（一个技术扩增子的DNA样品的）。PCR可以放大珍贵的DNA样本（如在犯罪现场）的几个分子产生大量的DNA，从50到长度超过25 000个碱基对。

在PCR中，两个短寡核苷酸（PCR引物）的设计，使得每个互补于在该区域的两个靶链之一的3'-端待扩增：两个PCR引物限定的扩增子。由引物结合模板的区域中的一系列的循环（扩增图1）。PCR需要的DNA聚合酶。而所有生物体含有DNA聚合酶，即在PCR中使用的聚合酶来自嗜热菌栖热菌属aquaticus。这Taq聚合酶是耐热的，这意味着高达95℃的温度下可在PCR中使用，低的条件DNA双链体的稳定性。

聚合酶链反应（PCR）

图1 | 的聚合酶链反应（PCR）

在第一周期中，双链靶被分离成通过加热两个单模板链至95℃。然后将其冷却至55℃，以允许合成的寡核苷酸引物退火到模板链与它们的3'端彼此相对。然后将温度升高到72℃，对于热稳定的Taq DNA聚合酶的活性最适温度。聚合酶使用脱氧核糖核苷三磷酸（dNTPs浓度），以引物沿着生产的DNA两个新的双链（模板的长度延伸。图2）。

PCR循环

图2 | PCR循环的聚合酶链式反应的单个周期。

PCR的第二周期是第一周期的重复，并且每个新合成的单链也可以作为引物退火和延伸的模板。聚合酶只能尽可能延长DNA作为第一引物的位点，产生特定长度的DNA双链体。在所有的后续周期的扩增产生的PCR产物由两个引物的位点特定的长度，而这些PCR产物很快多于原本的目标分子。在理论上，Ñ的PCR循环将产生2 Ñ PCR产物。

由凯利·穆利斯20世纪80年代发明的，聚合酶链反应已是穆利斯被授予了分子生物学，DNA诊断和法医学这样一个无处不在的影响诺贝尔奖。

引物二聚体的形成

不正确的扩增子在PCR中有时产生由于引物二聚体形成，其中，所述PCR引物杂交，和被放大的代替模板DNA（图3）。引物二聚体是最有可能以在PCR扩增开始时，当引物中存在的高浓度相对于模板。引物二聚体formatin可发生即使有几个错配的引物-二聚体双链体，其由结合于Taq聚合酶稳定。引物二聚体的形成是当几个PCR反应在同一个管（多重PCR）进行了一个特别的问题。

引物二聚体的形成

图3 | 引物二聚体形成的，而不是DNA模板扩增的形成与引物二聚体的扩增，可以对PCR产生不利影响。

在减少引物二聚体形成明显的步骤是，使它们具有低的自身互补来设计引物，但是这并不总是可能的，并且可能会导致引物二聚体的扩增甚至弱相互作用。“热启动”PCR技术已经发展到减轻引物二聚体的形成。在热启动PCR反应混合物最初缺少的重要组成部分，如Taq聚合酶，或Mg 2+（其中Taq聚合酶需要活性）。在第一周期开始长时间加热确保了所有的引物二聚体的变性，则该缺失的组件添加。PCR现在可以继续正常。该技术的主要缺点是污染的加入必须成分的，以打开反应管中的可能性。一个替代方法包括，关于加热解离的使用Taq聚合酶的非共价抑制剂（例如肽或抗体）。在另一方法中，PCR反应的一个重要组成部分是封闭在一个蜡丸，熔化在加热时，释放其内容。

DNA测序

所有这一切，因为在30年前由弗雷德·桑格在剑桥制定的方法是不可能的。桑格制定了关于他被授予他的第二个DNA测序（双脱氧法）的新方法诺贝尔文学奖，1980年。

桑格（双脱氧）DNA测序

桑格的DNA测序的双脱氧方法是常规地用于在实验室中的DNA测序的第一个方法。以下组件所需的Sanger测序：

DNA模板进行测序

在5'端标记的与寡核苷酸引物32 P

DNA测序聚合酶

四脱氧核苷三磷酸：的dATP，dGTP，的dCTP，dTTP的

四脱氧三磷酸核苷（缺少2'-和3'-羟基的三磷酸核苷）：的ddATP，的ddGTP，ddCTP的，ddTTP（图4）

桑格测序是一个修改形式的DNA复制。引物杂交到模板的特定位点与聚合酶结合，并结合核苷酸组装模板的反向互补拷贝。这一过程将不提供在模板上的序列和用于此目的4测序反应在分开的试管中进行的任何信息。在每个管中的关键成分的少量，2'，3'-二脱氧核苷三磷酸的溶液。双脱氧三磷酸核苷的ddATP加入到管1，的ddGTP至管2的ddCTP至管3和ddTTP到管4。

双脱氧核苷酸triphosphoates的结构（的ddNTPs）